تجزیه و تحلیل مقایسه ای و مولکولی جدایه های ca. phytoplasma aurantifolia در منطقه مرکزی ایران

بیماری فایتوپلاسمایی جاروک لیموترش به عنوان یکی از بیماری های مهمی که از کشورهای حاشیه خلیج فارس گزارش شده، در ایران نیزگسترش زیادی یافته است. ردیابی عامل بیماری جاروک لیمو ترش aurantifolia) (candidatus phytoplasma در درختان میوه، گیاهان زراعی، سبزی، زینتی و علف های هرز استان اصفهان در سالهای اخیر نشان دهنده دامنه میزبانی و انتشار قابل توجه این عامل بیماری در منطقه می باشد. با وجود انتشار قابل توجه این فایتوپاسما در ایران، هنوز معلوم نیست جدایه های مختلف ca. phytoplasma aurantifolia از میزبان های متنوع و شرایط جغرافیایی متفاوت چه تفاوت ها و شباهت هایی باهم دارند و این شباهت ها و اختلافات ژنتیکی تا چه حد در گسترش میزبانی و جغرافیایی این فایتوپلاسما تاثیر دارد. برای درک بهتر از تنوعca. phytoplasma aurantifolia، تعداد قابل توجهی از نمونه های گیاهی دارای علایم فایتوپلاسمایی از میزبان های مختلف این فایتوپلاسما شامل لیموترش، یونجه، سیب، بادام، هلو، شبدر، سیب زمینی و گوجه فرنگی در بازه زمانی اواخر شهریورماه تا اوایل آبان ماه1390، جمع آوری شد. پس از استخراجdna ، از واکنش nested-pcr با استفاده از جفت آغازگرp1/p7 و p1a/p7a در دور اول و جفت آغازگر r16f2n/r16r2 در دور دوم، برای ردیابی فایتوپلاسما در این نمونه ها استفاده گردید. به منظور تمایز گروه های فایتوپلاسمایی همراه با این نمونه ها، از تکنیک pcr-rflp استفاده شد. بدین منظور مقایسه الگوی برش آنزیمی قطعات تکثیر شده با واکنش nested-pcrو بکارگیری آنزیم های taqi، hinfi و hapii انجام گرفت. نتایج حاصل از pcr-rflp نشان داد که به غیر از فایتوپلاسماهای گروه aster yellows، فایتوپلاسماهای گروه peanut witches,–broom در ایجاد بیماری های فایتوپلاسمایی نمونه های مورد بررسی ، نقش مهمی دارند. نتایج حاصل از توالی یابی dna فایتوپلاسمایی و بررسی درخت فیلوژنتیکی جدایه های مربوط به گروه peanut witches,–broom نشان داد که جدایه های مورد نظر در دو گروه اصلی، از یکدیگر مجزا می شوند که جدایه های mm1، rs3، ah1، an1، app1 وapp8 (زیرگروه ia) بعنوان ca. phytoplasma aurantifolia طبقه بندی شدند. اعضای زیر گروه b با جدایه های یونجه (af2) و بادام ایرانی (pa14) هم گروه بودند که همه آنها شباهت زیادی به جدایه های cactus witches,–broom ، faba bean phyllodyو phytoplasma witches,–broom soybean داشتند که قبلا به عنوان زیر گروه c، گروه peanut witches,–broom طبقه بندی شده اند. در این تحقیق، جدایه های یونجه e2 (اردستان) و e3 (کرمان) به طور مشخصی از نمونه های دیگر جدا شدند و در گروه مجزای ii، قرار گرفتند، هرچند تعیین زیرگروه آنها ممکن نشد. از بررسی توالی های بدست آمده جدایه های لیموترش، بادام، سیب، هلو و یونجه در این تحقیق، تنوع قابل قبولی بین جدایه های گروه peanut witches,–broom مورد بررسی وجود داشت که این تنوع ارتباط معنی داری با نوع میزبان و منطقه جغرافیایی نداشت. این نتایج نشان داد که اگرچه روش pcr-rflp، برای گروه بندی فایتوپلاسماها توصیه شده است، ولی برای تشخیص دقیق عوامل فایتوپلاسمایی قابل اعتماد نیست. لذا برای تعیین گروه های فایتوپلاسمایی ضروری است که توالی ژن های حفاظت شده آنها با توالی فایتوپلاسماهای شناخته شده مقایسه گردد و استفاده انحصاری از آزمون pcr-rflp توصیه نمی شود. با نتایج پژوهش حاضر، حضور ca. phytoplasma aurantifolia و زیر گروه c گروه peanut witches,–broom در نمونه های ایران محرز گردید، اما تعیین زیرگروه برای تعدادی از جدایه ها با روش گروه بندی متداول، ممکن نشد و احتیاج به بررسی های بیشتر دارد. به کارگیری روش های دقیق گروه بندی مانند طراحی جفت آغازگرهای اختصاصی از توالی ژن های ریبوزبومی کمتر حفاظت شده جهت تعیین زیر گروه جدایه های مورد اختلاف گروه peanut witches,–broom، مورد توجه قرار خواهد گرفت.